Pan fydd arbrawf yn methu, ydych chi erioed wedi pwyntio bys at adweithyddion drud neu offer cymhleth? Ond weithiau, gall y "troseddwr" go iawn fod yn cuddio'n dawel yn y gornel - y botel hwnnw sy'n ymddangos yn gyffredin o adweithydd byffer. Er ei fod yn anamlwg, dyma'r achubiaeth ar gyfer cynnal cywirdeb yr arbrawf. Heddiw, byddwn yn datgelu cyfrinach y "gwarcheidwad anweledig" hwn.
Ⅰ. Clustog: Beth ydyw? Pam ei fod yn anhepgor yn y labordy?
Yn syml, mae byffer yn system ateb arbennig a all wrthsefyll effeithiau ychydig bach o asid ychwanegol, alcali neu wanhau a chynnal gwerth pH cymharol sefydlog yr ateb. Fel arfer mae'n cynnwys pâr o "bartneriaid" - asid gwan a'i sylfaen gyfun (neu sylfaen wan a'i asid cyfun), fel asid asetig/sodiwm asetad (HAc/Ac-), sodiwm dihydrogen ffosffad/disodium hydrogen phosphate (NaH₂PO₄/Na₂HPO₄), ac ati.
Gallu craidd: Sefydlogi pH a gwrthsefyll newidiadau!
Pan fydd ychydig bach o sylweddau asidig neu alcalïaidd yn cael eu cyflwyno'n ddamweiniol i'r arbrawf, bydd y "partner" yn y byffer yn ymateb yn gyflym, fel "porthor ïon hydrogen" effeithlon, gan ei amsugno neu ei ryddhau, a thrwy hynny osgoi amrywiadau llym yng ngwerth pH yr hydoddiant. Mae'r gallu hwn yn hanfodol ar gyfer llawer o adweithiau biocemegol sy'n dibynnu ar amgylchedd pH penodol.
Ⅱ. Cyfnod labordy: prif gymeriad anhepgor a rôl gefnogol
1. "System cynnal bywyd" o arbrofion biocemegol:
Ymchwil gweithgaredd ensymau:Dim ond o fewn ystod pH cul y mae gan y rhan fwyaf o ensymau y gweithgaredd gorau posibl. Mae byfferau (fel Tris-HCl, PBS) yn darparu "mainc waith" sefydlog ar gyfer adweithiau ensymau i sicrhau canlyniadau dibynadwy.
Puro protein a dadansoddi:O lysis celloedd, gwahaniad cromatograffig (cyfnewid ïon, cromatograffaeth affinedd) i electrofforesis (fel SDS-PAGE), crisialu a storio protein, mae angen byffer gyda pH penodol ar bob cam i gynnal strwythur, gwefr a hydoddedd y protein ac atal dadnatureiddio neu wlybaniaeth.
Trin asid niwcleig:Mae adwaith PCR, echdynnu DNA/RNA, treuliad ensymau, ligation, hybrideiddio a phrosesau eraill yn hynod sensitif i pH. Gall byfferau a ddefnyddir yn gyffredin fel TE (Tris-EDTA) sefydlogi adeiledd asidau niwclëig a'u hamddiffyn rhag diraddiad niwcleas.
2. "Hwiangerdd" o ddiwylliant celloedd:Mae cyfrwng meithrin celloedd (fel DMEM, RPMI) ei hun yn system glustogi gymhleth (yn aml yn dibynnu ar system sodiwm bicarbonad / carbon deuocsid). Gall ychwanegu byfferau ychwanegol (fel HEPES) ddarparu amgylchedd pH mwy sefydlog i gelloedd, yn enwedig wrth newid hylifau, arsylwi neu pan all crynodiadau carbon deuocsid amrywio, er mwyn sicrhau twf celloedd iach.
3. "grym sefydlogi" cemeg ddadansoddol:
Gwahaniad cromatograffig:Mewn cromatograffaeth hylif perfformiad uchel (HPLC) a chromatograffeg ïon (IC), pH y cyfnod symudol yw'r paramedr rheoli allweddol ar gyfer yr effaith gwahanu, ac mae byfferau (fel ffosffadau ac asetadau) yn sicrhau atgynhyrchedd y broses wahanu.
Dadansoddiad titradiad:Mae angen cynnal rhai adweithiau titradiad ar pH cyson neu nodi'r diweddbwynt pan gyrhaeddir pH penodol, ac mae'r byffer yn chwarae rhan sefydlogi.
Paratoi atebion safonol:Mae angen rheoli gwerth pH llawer o atebion safonol yn fanwl gywir, a byfferau yw'r sail.
Ⅲ. Dethol a defnyddio: llawer o wybodaeth
Dewiswch y system glustogi gywir:
Mae gwerth pKa yn allweddol:Mae amrediad byffro effeithiol byffer fel arfer o fewn ystod ei werth pKa ± 1. Gwnewch yn siŵr eich bod chi'n dewis byffer gyda gwerth pKa yn agos at y pH gweithio sydd ei angen arnoch chi! Er enghraifft, defnyddir ffosffad (pKa ~ 7.2) yn aml yn yr ystod pH niwtral, a defnyddir Tris (pKa ~ 8.1) yn aml mewn alcalïaidd.
Cydnawsedd:Ystyriwch a yw'r cydrannau byffer yn ymyrryd â'ch adwaith arbrofol (ee gall ffosffad ymyrryd â rhai astudiaethau ffosfforyleiddiad, a gall borate adweithio â siwgrau).
Cryfder a thymheredd ïonig:Mae cryfder ïonig yn effeithio ar weithgaredd ensymau, hydoddedd, ac ati; gall newidiadau tymheredd effeithio'n sylweddol ar werth pKa byfferau megis Tris (mae gan Tris gyfernod tymheredd pKa mawr o tua -0.031/ gradd ).
Ⅳ. Rhestr o Byfferau Cyffredin
1. cyfres byffer PBS
PBS byffer 1 × (pH7.4), PBS byffer 10 × (pH7.4), powdr ffosffad PBS (heb ïonau calsiwm a magnesiwm): golchi celloedd mewn arbrofion diwylliant celloedd (fel cyn newid y cyfrwng diwylliant); gwanhau gwrthgyrff a golchi platiau ELISA mewn arbrofion imiwnoleg; cynnal pwysedd osmotig a sefydlogrwydd pH mewn arbrofion protein / asid niwclëig, ac ati.
Clustogi DPBS (heb galsiwm a magnesiwm), powdr ffosffad DPBS (heb ïonau calsiwm a magnesiwm): cytometreg llif mewn arbrofion celloedd, golchi ar ôl treulio celloedd (er mwyn osgoi calsiwm a magnesiwm yn ymyrryd â gweithgaredd ensymau); gwanhau ensymau neu gynnal arbrofion sy'n sensitif i ïon mewn bioleg foleciwlaidd (fel rhai adweithiau PCR), ac ati.
Clustog PBST (1 ×), byffer PBST (10 ×): a ddefnyddir ar gyfer blocio a golchi camau yn Western Blot neu imiwn-histocemeg, gan leihau rhwymiad amhenodol, ac ati.
2. cyfres byffer TBS
Byffer TBS (1 ×), byffer TBS (10 ×): disodli byffer PBS mewn arbrofion imiwnoleg (er mwyn osgoi ymyrraeth ffosffad â rhwymiad gwrthgyrff penodol); sefydlogi amgylchedd pH alcalïaidd mewn arbrofion protein, ac ati.
3. cyfres byffer HBSS
Clustog HBSS (heb galsiwm a magnesiwm, heb ffenol goch)/byffer Hank (heb galsiwm a magnesiwm): gwahanu celloedd a golchi allgyrchol mewn arbrofion celloedd (fel cytometreg llif); cynnal a chadw celloedd tymor byr (fel delweddu celloedd byw), ac ati. byffer HBSS (heb galsiwm a magnesiwm, heb ffenol coch): cynnal gweithgaredd metabolaidd celloedd mewn diwylliant celloedd (mae calsiwm a magnesiwm yn cymryd rhan mewn trawsgludiad signal); arbrofion mudo/ymlediad celloedd.
4. cyfres byffer TE
byffer TE (1 ×), byffer TE (10 ×): hydoddi a storio DNA/RNA (Mae Tris yn cynnal pH, mae EDTA yn celu ïonau metel i atal gweithgaredd niwcleas); gwanhau DNA ar gyfer PCR, dilyniannu ac arbrofion eraill.
5. Cyfres byffer electrofforesis
Byffer TAE (1 ×): electrofforesis gel agarose confensiynol DNA (cydraniad isel, sy'n addas ar gyfer darnau DNA mawr). Byffer TBE (1 ×), byffer TBE (10 ×): electrofforesis DNA/RNA cydraniad uchel (fel darnau bach neu electrofforesis gel polyacrylamid); electrofforesis tymor hir (mae gallu byffro yn well na TAE).
6. Cyfres Clustogi Arbrawf Western Blot
Clustogi Western Blot Transfer (10 ×): Clustog a ddefnyddir i drosglwyddo proteinau o gel i bilen (fel pilen PVDF), sy'n cynnwys Tris, glycin a methanol.
Tris{0}}byffer HCl (1mol/L, pH6.8): Paratoi gel crynodedig SDS-PAGE, ac ati.
Tris{0}}byffer HCl (1.5mol/L, pH8.8): Paratoi SDS-PAGE gel gwahanu, ac ati.
7. cyfres byffer pH safonol
pH=4.00/6.86/9.18 byffer (wedi'i baratoi 250mL): hydoddiant safonol ar gyfer graddnodi mesurydd pH (ee mae pH6.86 yn safon niwtral, mae pH4.00 a 9.18 yn safonau asidig ac alcalïaidd).
Nid yw adweithyddion byffer yn rôl ategol sylfaenol yn y labordy o bell ffordd. Eu gwerth craidd yw darparu amgylchedd proton manwl gywir a sefydlog, sef y conglfaen ar gyfer cynnal yr ecwilibriwm thermodynamig a chyfradd cinetig y rhan fwyaf o adweithiau biocemegol. O reoleiddio micro-amgylchedd safleoedd actif ensymau, i warantu sefydlogrwydd cydffurfiadol biomacromoleciwlau, i gynnal graddiannau ïon trawsbilen, mae gallu byffro pH y system glustogi yn rhagofyniad anhepgor ar gyfer ailadrodd a dibynadwyedd data arbrofol. Bydd Beekman yn eich hebrwng ar eich taith ymchwil wyddonol.
Hunan BKMAM dal Co., Ltd
Gwefan: www.bkmbio.com
E-bost:info@bkmbio.com